TP Biochimie Chromatographie

1. DEFFINITION DE LA CHROMATOGRAPHIE :


Technique d'analyse chimique
utilisée pour séparer les constituants d'un mélange. Cette technique
est fondée sur le principe de l'adsorption sélective des différents
constituants (phase mobile) sur une phase fixe ou sur leur partage en
présence de phases liquides ou gazeuses. La chromatographie fut
découverte en 1906 par le botaniste russe, Mikhaïl Tsvet, mais il
fallut attendre les années 1930 pour qu'elle soit largement utilisée.
Tsvett avait constaté la séparation des constituants colorés de la
chlorophylle brute lorsque sa solution montait le long d'un papier
filtre. Les différents constituants formaient en effet des bandes de
couleurs distinctes à des hauteurs différentes.


2. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CPG) :

Elle est assez récente et
permet de séparer des mélanges de gaz ou de composés vaporisables à
haute température. Le mélange à analyser est injecté dans une colonne
métallique de quelques millimètres de diamètre, enroulée sur elle-même
et contenant la phase fixe. Les composés sont véhiculés sous pression
par un gaz inerte, le gaz vecteur. Il s'agit de l'hélium ou de l'argon.
Le temps que met un constituant gazeux pour parcourir la colonne est
son temps de rétention, qui est caractéristique du composé. Les
constituants sont ainsi séparés par la différence entre leurs temps de
rétention respectifs. Le choix de la phase stationnaire est déterminant
pour la réussite de la séparation. Cette phase est choisie selon sa
porosité et ses interactions avec la phase mobile, qui dépendent en
particulier de la différence de polarité entre les deux phases. La
chromatographie en phase gazeuse est un moyen de séparation très
efficace. Elle est utilisée dans les raffineries et dans l'industrie
chimique. On peut la coupler avec la spectroscopie de masse pour
séparer puis déterminer la nature et la masse des constituants d'un
mélange vaporisé.


3. CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE :

Il existe différents types de chromatographie en phase liquide :



3.1 Chromatographie par adsorption :

L'appareillage est constitué
d'une colonne en acier inoxydable, remplie de particules solides de
diamètre inférieur à 20 µm. Cet adsorbant est en général l'alumine ou
le gel de silice. Quelques micro litres de la solution à analyser sont
introduits en tête de colonne. Les constituants séparés en sortie de
colonne sont détectés par spectroscopie UV ou par réfractomètre. Comme
son nom l'indique, cette chromatographie est fondée sur l'adsorption
sélective des constituants liquides sur la phase solide de la colonne.
En fait, il se produit une succession d'adsorptions et de désorptions,
ces dernières étant provoquées par l'ajout d'un solvant en fin de
séparation.

3.2 Chromatographie de partage liquide-liquide :

Elle utilise la différence de solubilité des constituants vis-à-vis de deux liquides non miscibles.

3.3 Chromatographie par perméation de gel (GPC) :

C'est une méthode qui a subi
un fort développement ces dernières années. Elle utilise la différence
de pénétration des constituants sur un gel de polymère. Les molécules
dont le diamètre est inférieur à une certaine valeur sont les seules à
pouvoir pénétrer dans les pores du gel et sont donc retardées dans leur
traversée de la colonne. Les composés sont ainsi séparés selon la
taille de leurs molécules.

3.4 Chromatographie par échange d'ions :

Elle utilise l'échange d'ions
entre la phase fixe, résine constituée d'ions, et la phase mobile
préalablement ionisée. Les ions sont en général des acides, des bases
ou des cations métalliques. La chromatographie par échange d'ions est
employée pour des substances ionisables, en particulier en chimie
minérale.

3.5 Chromatographie sur papier :

Le mélange à analyser est
préalablement mis en solution. On dépose une petite tache de ce mélange
liquide sur une feuille de papier. Le solvant migre par capillarité,
entraînant avec lui les différents constituants, qui s'arrêtent plus ou
moins loin de la tache initiale selon leur interaction avec la
cellulose du papier.



3.6 Chromatographie sur couches minces ( CCM) :

C'est une technique semblable
à la chromatographie sur papier, la phase fixe étant une fine couche
d'adsorbant déposé sur une plaque de verre.

La chromatographie est
largement utilisée en laboratoire et dans l'industrie pour l'analyse
des aliments, des stupéfiants, des produits pétroliers et des produits
de fission radioactive.

La chromatographie des sucres par CCM. On à vue l’exemple du SACCHAROSE.

4. SACCHAROSE :

Le saccharose est un sucre de formule chimique C12H22O11,
appartenant au groupe de glucides connus sous le nom de disaccharides.
C'est le sucre de table ordinaire, extrait de la betterave sucrière et
de la canne à sucre. Il est soluble dans l'eau et dans une moindre
mesure dans l'alcool et l'éther. Lorsqu'il cristallise, le saccharose
forme de longues aiguilles minces faites de cristaux dextrogyres (qui
dévient vers la droite le plan d'une lumière polarisée). Soumis à une
hydrolyse, le saccharose donne un mélange de glucose et de fructose,
deux sucres lévogyres (qui dévient vers la gauche le plan d'une lumière
polarisée). Le mélange obtenu est de ce fait appelé sucre inverti et le
processus correspondant inversion. L'inversion s'effectue dans
l'intestin des êtres humains à l'aide de deux enzymes, l'invertase et la
sucrase. Lorsqu'il est chauffé à des températures supérieures à 180
°C, le saccharose se transforme en une substance amorphe, brune et
sirupeuse appelée caramel.

II. Partie pratique :

a) But de manipulation :
L’objectif de cette manipulation est de séparer les constituants du Saccharose.


b) Principe :
La
règle de base est la suivante : Pour séparer deux composés, on exploite
leur différence de répartition entre deus phases ( Stationnaire et
Immobile).

c) Le matériel utilisé:

· Plaque de gel de silice
· Sèche cheveux
· Cuvette à révélation
· Une grosse pince
· Eprouvette
· Entonnoir
· Cuve ( ou Becher) de 250 ml avec couvercle
· Papier filtre


d) Réactifs utilisés :

Ø Le solvant à chromatographie des glucides, constitué de :
60% de méthyle- éthyle- cétone
20% d’acide acétique glacial
20% de méthanol

Ø Le révélateur, composé de :
2% de permanganate de potassium
4% de carbonate anhydre de sodium

Ø Solution d’HCl à une foie normal pour hydrolyser le saccharose

Ø Solution de glucose, saccharose et de fructose à 20gr/l

e) Mode opératoire :
Il y on à 5 étapes, ce sont :

1. Hydrolyser le saccharose :
® Le
réactif le plus utiliser ( fréquenter) pour casser la liaison entre le
glucose et le fructose c’est l’HCl ( Cette étape dure 30 minutes à
température de 100°C).


2. Préparation du solvant :
l Mélanger 20% d’acide acétique glacial, 20% de méthanol et 60% d’un mélange entre méthyle- éthyle- cétone.

l Verser le mélange ( solvant) dans une cuve jusqu’à obtention plus ou moins un centimètre de hauteur.

l Fermer la cuve avec le couvercle.

l Tromper le papier filtre dans la cuve pendant un quart d’heure pour saturer l’atmosphère.

3. Manipulation :

   A l’aide d’un crayon,
   on trace un trait de 1.5 cm au bord inférieur sur la plaque de gel de
   cilice. Puis on place 3 repères équidistants ( à distances égales).


   A l’aide d’une micro
   pipette ou seringue, on dépose sur les repères tracés précédemment 3
   fois une goutte de chaque solution de sucre afin que chaque dépôt soit
   suffisamment concentré.

   Sécher entre chaque dépôt on utilisant un sèche- cheveux.


   Mettre la plaque dans la cuve ( les dépôts doivent être au-dessus du solvant).


   Fermer la cuve avec le couvercle et laisser migrer jusqu’à ce que le font du solvant est environ 1cm du haut de la plaque.


4. Préparation du révélateur :

® Verser
10ml de permanganate de potassium à 2% dans une éprouvette à l’aide
d’un entonnoir puis verser le même volume ( c’est à dire 10ml) de
carbonate anhydre de sodium à 4%.

® Verser le mélange ( révélateur) dans une cuvette à révélation.


5. Révélation :

® Sortir la plaque de la cuve.

® Sécher la plaque en utilisant le sèche- cheveux jusqu’à disparition complète de l’odeur d’acide acétique.

® Plonger la plaque dans le révélateur à l’aide d’une pince en recouvrant le gel de silice pendant 10 secondes environ.

® Relever la plaque du révélateur et sécher à nouveau
f) Dessin de la plaque de chromatographie en utilisant le papier transparent:


g) Interprétation du résultat:


En général : Rf = d /D

D’après la plaque : D = 6,4 cm

1. Calculer le Rf du glucose ( témoin) :
Rf glucose = d glucose /D
Rf glucose = 3,1 /6,4
Rf glucose = 0,484


2. Calculer le Rf du fructose ( témoin) :
Rf fructose = d fructose /D
Rf fructose = 3,1 /6,4

Rf fructose = 0,437




3. Calculer le Rf du saccharose ( échantillon) :

Normalement sur la plaque on
observe deus points pour le saccharose ( Rf’ et Rf’’). Mais
malheureusement on à pas eu cette chance.
Il n’à apparu qu’un seul point ( Rf’).
Rf’ saccharose = d saccharose /D
Rf’ saccharose = 2,8 /6,4

Rf’ saccharose = 0,437


Le Rf’ correspond au Rf fructose. Alors le point apparu n’est donc que le résultat du fructose seulement.

h) Discutions:

Normalement le saccharose
laisse migrer deus substances ( 2 points). La première est celle du
glucose, l’autre est celle du fructose.

Dans notre expérience n’est
apparu qu’un seul point ( c’est à dire qu’une substance migrée). Ce
problème est dû probablement de l’hydrolyse du saccharose ( soit une
erreur dans la normalité d’HCl ou bien dans la température).



III. CONCLUSION :

L’avantage le plus important
d’une séparation par chromatographie sur une couche mince c’est qu’il
est très efficace. Un seul passage permet de séparer plusieurs
échantillons à la fois. Mais il est nécessaire de suivre les étapes
mentionnées ci dessus

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